HPLC (high-performance liquid chromatography) 란?
HPLC는 화합물을 분리하고 식별하는 데 사용되는 분석 기술 중 하나로, 고정상과 이동상 그리고 시료와의 상호작용으로 혼합물을 분리시키는 방법이다.
일반적으로, HPLC 시스템은 샘플을 주입하고, 액체 이동 상에 따라 분리되는 칼럼을 통과시킨다. 이 칼럼은 일종의 특별한 재질로 구성되어 있어서 샘플의 성분을 분리한다. 분리된 성분은 감지기를 통해 감지되고, 이를 통해 각 성분의 양과 식별이 가능하다. 이번 글에서는 HPLC를 통해 카페인 함량시험 방법에 대해 알아보고자 한다.
시험 방법
1. 이동상 제작: 메탄올 50ml, 물(초순수) 50ml, 초산 0.1ml의 비율로 제작하여 이동상 병에 넣어준다 (그 이상 넣는 경우 해당 비율로 넣는다)
2. HPLC에 이동상을 연결한다. Purge를 수행한다.
3. HPLC에 column을 연결한다.
4. Set-up pump를 선택하여 pump 조건을 설정한다. 아래 시험조건으로 Method를 만든다.
| No. | HPLC 구성 | Items | Description |
| 1. | Pump | Mobile phase | 메탄올:초산:물 = 50:0.1:50 |
| 2. | Pump | Flow rate | 1.0 mL/min |
| 3. | Pump | Run time | 3 min |
| 4. | Auto sampler | Injection vol. | 10 μL |
| 5. | Column oven | Selected Column | C18 Column 15cm |
| 6. | Column oven | Column oven temp. | 30 ℃ |
| 7. | Detector | Detection | UV 280nm |
5. 설비, 컬럼을 equilibrium 시킨다. Online plot에 나타난 그래프가 직선이 나타날 때까지 이동상을 이동시킨다.
6. Blank 주입
6.1. 이동상을 실린지 필터로 여과하여 HPLC용 vial에 담는다.
6.2. Injection volume을 10μL로 설정하여 Auto sampler에 주입한다.
7. 표준액 주입
7.1. 표준원액(농도 3000ppm) 제작: 카페인 표준품 0.15g을 초순수 50mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
7.2. 표준액1 (농도 300ppm) 제작: 표준원액 1mL를 초순수 10mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
7.3. 표준액2 (농도 120ppm) 제작: 표준원액 1mL를 초순수 25mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
7.4. 표준액3 (농도 60ppm) 제작: 표준원액 1mL를 초순수 50mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
7.5. 표준액 1,2,3을 각각 일회용 syringe(주사기)에 약 1-1.5mL 넣어 일회용 syringe filter로 여과하여 HPLC vial에 담는다. HPLC cap으로 닫아준다.
8. 검체 주입
8.1. 검체1(농도 1200ppm) 제작: 카페인 검체 0.12g을 초순수 100mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
8.2. 검체2 (농도 120ppm) 제작: 검체1을 초순수 10mL가 담긴 플라스크에 넣는다. Magnetic bar를 넣고 교반기에서 교반한다.(3-10분)
8.3. 검체를 syringe(주사기)에 약 1-1.5mL 넣어 일회용 syringe filter로 여과하여 HPLC vial에 담는다. HPLC cap으로 닫아준다.
9. 표준액 1,2,3 및 검액을 Injection volume을 10μL로 설정하여 Auto sampler에 각각 1회 주입한다.
시험 결과 분석
1. Data analysis 또는 Offline으로 접속하여 시험 결과를 확인한다.
2. 표준액 1,2,3 및 검액을 각각 적분하여 Peak area를 확인한다.
- Blank에서 검출된 peak는 제외한다.
3. 카페인 검체의 함량을 계산한다. (아래 계산식 1,2로 각각 구해본다.)
① 계산식 1: 경량선 이용 [y=ax+b]
1) 표준액 1,2,3의 검량선을 확인한다.
2) 결과를 표에 작성하고 판정한다.
| Items | Acceptance criteria | Results | 판정(적합/부적합) |
| Linearity | R ≥ 0.99 이상 | R: 0.99987 | 적합 |
| y=ax+b (a: 기울기, b: y절편) |
a: 21.63887 b: 51.03990 |
N/A |
* R 값이 0.99 이상이면, Linearity(직선성)가 있다고 판단하며, 표준액 1에서 3까지의 범위에서 정량성을 갖는다. 여기서는 60ppm(표준액3)~300ppm(표준액1)이 범위이다.
3) 카페인 검체의 함량을 계산한다.
- 검액의 Peak area를 y에 대입하고, x(검체의 함량)를 구한다.
- 결과를 표에 작성하고 판단한다.
② 계산식 2: 같은 농도비인 표준액 2와 검액으로 계산
| Items | Acceptance criteria | Results | 판정(적합/부적합) |
| 함량(Assay) | 80.0~125.0% | 101% | 적합 |