RT-PCR(2)_cDNA synthesis

이번 글에서는 RNA extraction 다음 단계인 cDNA 합성에 대해 알아보도록 하자.

RNA extraction → cDNA synthesis → PCR

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cDNA 란?

cDNA는 complementary DNA로 mRNA를 주형으로 역전사효소와 DNA 중합효소에 의해 합성된 DNA이다. RNA로부터 cDNA를 합성하는 이유는 진핵세포 유전자가 intron을 포함하고 있기 때문이다. Post transcription regulation 과정을 거친 RNA는 intron을 포함하지 않는다. 이 RNA를 통해 exon만으로 이루어진 cDNA를 만든다.  앞선 과정을 통해 만들어진 RNA를 cDNA로 합성하는 과정에 대해서 알아보자.

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cDNA synthesis protocol

1. 정량한 RNA 9μl에 Oligo dT를 1μl 넣는다.

- Oligo dT : polyA tail을 가진 mRNA의 역전사 반응용 primer

 

2. 65℃에서 5분 heating(primer  붙이기), ice에서 1분간 chilling

 

3. master mix 10μl 첨가

 

4. incubate: 42℃, 5m → 50℃, 90m → 95 ℃, 5m

 

5. 완성된 cDNA는 -20℃에서 보관