Immunohistochemistry(IHC)

IHC란?

Immunohistochemistry(IHC)는 항원-항체 특이 반응을 이용하여 조직 또는 세포 내의 특정 항원의 존재 유무나 위치를 알아내는 방법이다. 

이번 글에서는 IHC 간접염색법에 해당하는 ABC 방법으로 염색하는 방법에 대해 알아보도록 하자.

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ABC(Avidin-Biotin Complex) 법

avidin. streptavidin이 당단백질 biotin에 대해 가지는 높은 친화력에 기초한다. avidin, streptavidin 모두 biotin에 대해 4개의 결합 부위를 가지고 있다. Horseradish peroxidase reaction에 의해 avidin 또는 streptavidin이 비오틴화 되어 있는 2차 항체에 반응한다는 것이 이 염색법의 기본 원리이다.

 

 

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IHC protocol

1. Xylene 5m ×3

 

2. Hydration

100% EtOH 1m → 95% EtOH 1m → 90% EtOH 1m → 80% EtOH 1m → 70% EtOH 1m

 

3. Washing

<Washing step>
① PBS washing 2ml
② PBS 침적 (5m)
③ High-salt PBS deposition (2m)
- 10x PBS : D.W. 225ml + 10x PBS 25ml
- High-salt : D.W. 45ml + 10x PBS 5ml + NaCl 0.77g

 

4. Endogeneous peroxidase block & Permeabilization

H2O2 : MeOH : PBS = 1:1:8의 비율로 혼합한 용액을 슬라이드 위에 침적 (20m)

- PBS(phosphate buffer saline)

- 조직 내 endogenous peroxidase로 인해 비특이적 background staining이 생기는 것을 방지

 

5. Washing

 

6. ImmEdge pen으로 조질 절편 주위 경계 그리기

 

7. Blocking

1.5% goat serum(ABC kit normal serum 150μl + PBS 9,85ml)을 슬라이드 위에 침적 (20m)

 

8. 1.5 goat serum 걷어냄

 

9. 1st Antibody binding

2.5% goat serum에 희석된 1st Antibody를 슬라이드 위에 침적 (Antibody의 종류에 따라 희석 배수, 시간 조절)

- Negative Control에는 X

 

10. Washing

 

11. 1.5% goat serum에 희석된 2nd Antibody를 슬라이드 위에 침적 (30m)

- 기다리는 동안 ABC Reagent 준비

- ABC Reagent: 1x PBS 2.5ml + Reagent A + Reagent B

 

12. Washing

 

13. Avidin, Biotinylated HRP binding 

ABC Reagent를 슬라이드 위에 침적 (30m)

 

14. Washing

 

15. DAB mix 제작 : D.W. 2,5ml에 DAB stock, H2O2, buffer stock 각 한 방울씩 (약 50 μl씩)

- 사용하기 직전에 제작해야함

 

16. DAB mix를 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 2-3분 동안 현미경으로 발색 정도 확인

 

17. 발색이 충분히 됐으면 D.W.에 washing

 

18. Counter stain

Hematoxylin에 염색 (10m)

 

19. 수돗물에 washing

 

20. Dehydration

70% EtOH 30s → 80% EtOH 30s → 90% EtOH 40s → 95% EtOH 40s → 100% EtOH 1m

 

21. Xylene 5m ×3

 

22. Mounting

Canda balsam 떨어뜨린 후 cover glass로 덮는다.