RT-PCR(1)_RNA extraction

RT-PCR을 진행하기 위해서는 아래와 같은 일련의 과정이 필요하다. 오늘은 그 첫 단계인 RNA extraction에 대해 알아보도록 하자. 

RNA extraction → cDNA synthesis → PCR

 

---

 

RNA extraction이란?

생물학적 sample로부터 순수한 RNA를 정제하는 것이다. 이는 PCR, sequencing 등 다양한 실험을 위해 필수적이며 sample의 종류와 실험 목적에 따라 여러 방법과 protocol이 사용된다. 

이번 글에서는 TRIzol을 이용한 RNA extraction에 대해 알아보도록 하자.

---

RNA extraction protocol

1. TRIzol을 조직 100mg당 1ml(=1000 μl) 첨가하여 균질한다. (ice에서 15m 이상 대기)

- TRIzol : RNAse 불활성화, 세포막 파괴, 산성으로 RNA만 선택적으로 분리할 수 있도록 함

 

2.  TRIzol 1ml 당 chloroform 0.2ml 첨가 후 50회 inverting (ice에서 15m 이상 대기)

- chloroform : phenol 성분 제거, RNA/DNA/단백질로 상 분리

 

3. centrifuge(12000xg, 15m, 4℃)

chloroform 첨가 후 원심분리한 모습

 

4. 가장 상층의 투명한 층을 다른 tube로 옮긴다.

 

5. isopropanol을 상층액과 동일한 양을 첨가하여 50회 inverting (ice에서 15m 대기)

- isopropanol : RNA 침전 유도

 

6. centrifuge(12000xg, 15m, 4℃)

isopropanol 첨가 후 원심분리한 모습

 

7. pellet 생성, 상층액을 따서 버린다.

 

8. 70% EtOH를 이용해 washing

- 70% EtOH : isopropanol을 씻어냄

 

9. centrifuge(7500xg, 8m, 4℃)

 

10. EtOH를 완전히 제거하고 pellet이 투명해질 때까지 airdry

 

10. pellet의 크기에 따라 20-50μl의 0.1% DEPC water를 넣어 pipetting하여 pellet을 녹인다.

- DEPC water : RNAse의 활성을 억제하여 RNA 보호

- 나노드랍 설정시 blank는 DEPC water로 함

 

11. 나노드랍으로 RNA 농도를 측정하여 정량한다.

- A260/280(DNA 오염도): 1.8-2.0 적정

- A260/230(유기용매 오염도): 1.8-2.0 적정