RT-PCR(3)_PCR

이번 글에서는 PCR에 대해 알아보도록 하자.

RNA extraction→cDNA synthesis→PCR

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PCR이란?

중합효소연쇄반응으로 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다.

PCR은 실험 목적에 따라 RT-PCR, real-time PCR 등의 다양한 방법으로 진행된다. 오늘은 그중에서도 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 대해 알아보자.

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PCR protocol

1. PCR sample 조성

 - smaple이 2개 이상일 경우 lose를 고려하여 mix 조성

PCR D.W	13.7μl
10x buffer	2μl
dNTP	1.6μl
cDNA	1μl
forward primer	0.8μl
reverse primer	0.8μl
taq	0.1μl
total	20μl

 

- buffer : 공통 이온 효과에 의해 용액의 수소 이온 농도가 크게 변하지 않는 완충용액 → 효소의 활성을 최적화

- dNTP : 3개의 인산이 결합된 deoxyribonucletide로 DNA 합성의 재

- cDNA : 복제의 주형이 되는 template

-primer : 증폭하고자 하는 유전자에 특이적이며 상보적인 서열로 구성된 단일 가닥의 DNA 단편

- taq polymerase : 고온내성 DNA 중합효소

 

2. PCR cycle setting

35cyc	step 1	step 2			step 3
Temp	95.0℃	52.0℃	72.0℃	72.0℃	4.0℃
Time	5:00	0.35	0:40	5:00	∞

- 빨간색으로 표시한 사이클수(cyc)와 온도는 sample의 상태, 종류 등에 따라 유동적으로 조절한다.

PCR step

 

① step 1(denaturation): 가열을 통해 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리

② step 2(annealing): primer가 상보적인 염기서열을 갖는 DNA와 결

③ step 3(elongation): DNA의 신장